中华消化杂志,,41(2)刘鑫,李燕妮,王一,等

摘要

目的

通过全外显子组测序(WES)技术筛查原发性胆汁性胆管炎(PBC)家系共有的低频变异位点，以期发现与PBC相关的新易感基因。

方法

收集年1月至年12月医院诊断的3个PBC家系的7例PBC患者和2名健康对照者的临床资料，提取血液DNA样本并进行WES，应用SAMtools1.3软件检测基因单核苷酸多态性(SNP)和得失位变异位点，并于已知数据库Genome、ExAC、ESP和诺禾-中华基因数据库筛选低频变异位点。应用PymolV2.3.2软件模拟主要组织相容性复合体-Ⅱ(MHC-Ⅱ)分子三维结构，观察家系间共有变异位点对应的氨基酸位置。

结果

7例PBC患者首诊年龄为(61.2±10.2)岁。血清检测结果示7例患者的ALP为(.9±.5)U/L，GGT为(.7±85.9)U/L，ALT为(47.6±33.1)U/L，AST为(55.7±34.1)U/L，免疫球蛋白G为(14.9±3.1)g/L；抗核抗体核型均存在胞质颗粒型特征；抗线粒体抗体均为阳性。5例PBC患者出现腹腔内淋巴结肿大；2例患者合并肝外自身免疫病；2例患者肝脏活组织检查结果均提示界面性肝炎和小胆管病变。3个PBC家系间共有18个SNP位点，分别位于OTOA、OBSCN和人类白细胞抗原-DRB1(HLA-DRBI)基因。OTOA基因的rs是3个家系共有的多态性位点；OBSCN基因的rs、rs、rs、rs和rs分别导致9种氨基酸的改变；基因HLA-DRB1共有12个不同的SNP位点，分别导致12种氨基酸的改变，其中rs、rs和rs核苷酸突变分别导致MHC-Ⅱ分子β链的GA、YC和YX氨基酸改变，YX氨基酸位于MHC-Ⅱ分子与抗原肽结合凹槽区域。

结论

对PBC家系进行WES是阐明恶性变异候选基因OBSCN和OTOA较好的策略。HLA-DRB1为PBC的易感基因，可能通过改变氨基酸序列影响MHC-Ⅱ分子介导的抗原提呈过程。

原发性胆汁性胆管炎(primarybiliarycholangitis,PBC)是以肝内小胆管非化脓性炎症为特征的胆汁淤积性肝病，可导致肝纤维化[]。PBC的发病机制涉及遗传和环境等因素，遵循复杂、多基因遗传模式。全基因组关联分析(genome-wideassociationstudy,GWAS)研究发现多个与PBC相关的易感基因，包括人类白细胞抗原-DRB1(humanleucocyteantigen-DRB1，HLA-DRB1)、肿瘤坏死因子配体超家族成员15及其信号转导和转录激活因子4等[]。目前针对PBC家系易感基因的研究甚少，本研究通过全外显子组测序(wholeexomesequencing,WES)技术筛查PBC家系患者共有的低频变异位点，以期发现与PBC相关的新易感基因。

对象与方法一、研究对象

回顾性收集年1月至年12月医院确诊且随访资料完整的例PBC患者的临床资料。PBC诊断需满足以下条件中的至少2条[]：①ALPU/L或GGT49U/L；②抗线粒体抗体(anti-mitochondrialantibody,AMA)或其他PBC特异性自身抗体如抗gp抗体、抗sp抗体中任意一项呈阳性；③肝脏病理检查结果提示慢性非化脓性胆管炎和中小胆管破坏。PBC家系纳入标准：①所有患者均符合PBC诊断标准[]；②所有患者及其一级亲属均无酗酒和药物滥用史；③PBC患者的一级亲属中≥1人诊断为PBC。PBC家系排除标准：①任意患者及其一级亲属患有病毒性肝炎或其他肝病；②PBC患者的一级亲属中无人诊断为PBC；③PBC患者及其一级亲属的临床资料缺失。

在例PBC患者中筛选出3个PBC家系(图1)，包括7例女性PBC患者(家系1的Ⅰ-2和Ⅰ-3；家系2的Ⅰ-2和Ⅰ-3；家系3的Ⅰ-2、Ⅰ-3和Ⅱ-1)和2名健康对照者(家系3的Ⅰ-1和Ⅱ-2)。本研究通医院伦理委员会审核批准(IRB-KY-)，所有研究对象均签署知情同意书。图13个PBC家系图谱　A　家系1　B　家系2　C　家系3二、研究方法1．血液样本收集和DNA提取：

采集每例PBC家系患者和每名健康对照者的静脉血各5mL，乙二胺四乙酸抗凝后于-80℃冰箱中保存。使用血液基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA样本。应用NanoDrop分光光度仪(美国Thermo公司)测量DNA的纯度和浓度并进行质量控制，以波长、nm处的吸光度比值来检验DNA样本的质量，当波长、nm处的吸光度比值为1.8～2.0时，视为合格样本[]。将合格样本置于冻存管内，于-80℃冰箱中保存、备用。

2．WES：

在HiSeq平台(北京诺禾致源科技股份有限公司)进行DNA样本的WES。构建DNA文库后，捕获基因外显子并进行文库质量检查。根据DNA文库中所有DNA样本的有效浓度和数据进行PE测序，得到最终的DNA测序文库并进行高通量测序，读取各DNA样本的碱基信息。将有效测序数据进行生物信息学过滤得到高质量数据，过滤原则为每份合格样本需产生≥8GB外显子测序数据量，平均覆盖倍数达倍，各样本原始测序数据的碱基质量值85%。应用SAMtools1.3软件检测基因的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)和得失位变异位点，并于已知数据库Genome、ExAC、ESP和诺禾-中华基因数据库筛选基因变异位点，过滤变异频率≥0.01的基因多态性位点，得到低频变异位点，筛选出在外显子区域或剪接位点区域总长度≤10bp的低频变异位点，去除其中的同义突变位点，得到非同义突变位点。应用SIFT(

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